BAC提取前準(zhǔn)備（前兩天 ）

    配制含25 mg/l Kan的LB培養(yǎng)基選擇平板，在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)從購(gòu)買的BAC劃線接種至選擇平板，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，供選擇單。ELISA試劑盒

BAC提取前準(zhǔn)備（前一天）

、在超凈工作臺(tái)上，用50 µg/ml Kan和液體LB培養(yǎng)基配制成25 mg/l Kan培養(yǎng)基，每個(gè)Falcon試管分裝0 ml。也可先分裝0 ml無抗生素的液體LB培養(yǎng)基后，然后每管中加5 µl濃度為50 µg/ml Kan溶液。

2、在培養(yǎng)皿中標(biāo)出三個(gè)單克隆 （不要太大，不要太小），用牙簽挑取第個(gè)單克隆 一半，在的的小培養(yǎng)皿固體LB培養(yǎng)基（分裝0 ml，含25 mg/l Kan）上劃一橫線，標(biāo)上序號(hào)；接著用同一根牙簽挑取第個(gè)單克隆的另一半接種到剛配制好的液體培養(yǎng)基中。第2、3個(gè)單分別用牙簽挑取在同一個(gè)小培養(yǎng)皿固體LB培養(yǎng)基上劃一橫線，分別標(biāo)上序號(hào)。

3、接種的固體培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱過夜。接種到Falcon試管中的E.coli 進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)（37℃，240 rpm）20小時(shí)。

BAC提取（第二天）

    將緩沖液P按要求加入RNase A，置于冰上。緩沖液P3也置于冰上。取出適量緩沖液QF在65℃條件下預(yù)熱。其他緩沖液在常溫下保存。

、接種的固體培養(yǎng)基從37℃培養(yǎng)箱中取出，用包裝膜封好后置于4℃條件下貯存。取液體振蕩培養(yǎng)的Falcon試管到超凈工作臺(tái)中，在微量離心管中分裝300 µl的E.coli 和300 µl 30%glycerol的LB培養(yǎng)基，用移液器上下吹吸混勻，置于-80℃貯存。

2、將Falcon試管在室溫條件下2700 rpm離心20 min。丟棄上清，將沉淀置于冰上。

3、在0.6 ml緩沖液P中重懸細(xì)菌沉沉小球。邊吹吸邊攪動(dòng)，混勻而不要出塊菌塊，然后全部轉(zhuǎn)移到2 ml 微量離心管中。ELISA試劑盒

4、加入0.6 ml緩沖液P2，上下倒置數(shù)次，輕輕混和，在室溫下培養(yǎng)5 min。

5、加入0.6ml冰冷的緩沖液P3，立即上下倒置數(shù)次，輕輕混和，在冰上培養(yǎng)5 min。

6、用微量離心器在zui大速度下（3000 rpm）離心0 min。此時(shí)可支起過濾架，標(biāo)好QIAGEN-tip 20尖管。

7、利用 ml緩沖液QBT對(duì)QIAGEN-tip 20尖管進(jìn)行平衡處理，讓其在重力作用下從柱中流出。

8、將離心后的上清倒入QIAGEN-tip 20尖管，讓其在重力作用下進(jìn)入樹脂。

9、用4 ml緩沖液QC對(duì)QIAGEN-tip 20尖管進(jìn)行清洗2次，每次用2 ml。

0、清洗后將.5 ml或2 ml微量離心管置于QIAGEN-tip 20尖管頭下，用0.8 ml預(yù)熱的緩沖液QF分兩次稀釋DNA 。每次0.4 ml。

、用0.7體積（每0.8 ml稀釋體積用0.56 ml）的isopeopanol在室溫下沉淀DNA 。立即用微量離心機(jī)中在3000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心30 min。此步以后在離心機(jī)上操作要注意離心管的放置方向，保持沉淀方向一致或作好標(biāo)記。以利于用移液管移吸上清，不會(huì)攪動(dòng)沉淀。另外，抽吸剩下少量（約 50 ml）溶液可再離心一次，之后全部吸出上清。

2、用 ml 70%酒精加入微量離心管中（洗滌DNA ），在3000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心5 min。先用移液器從沉淀小球?qū)γ嬉迫ゴ蟛糠志凭槲Ｏ律倭浚s50 ml）溶液再置于3000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心5 min。然后移出酒精，在通風(fēng)處或超凈工作臺(tái)送風(fēng)條件下風(fēng)干，但不宜過干，過干很很難溶解。

3、用20 µl TE緩沖液（pH 8）溶解DNA ，置于冰上，每0 min 彈擊微量離心管，以促進(jìn)DNA 溶解。之于置于4℃條件下過夜。ELISA試劑盒

4、第三天可將DNA 取出，在60℃條件下預(yù)熱一小時(shí)，每0 min 彈擊微量離心管，以促進(jìn)DNA 溶解。之后在%的瓊脂糖膠上鑒定。